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      基于人源Cdc25C蛋白融合表達研究

      2013-06-26 14:31 來源:生物醫學論文 人參與在線咨詢

      材料與方法

      1.材料:MCF-7細胞由本實驗室保存;感受態大腸桿菌DH5α、BL21及質粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;DMEM培養基購自GIBCO生物公司;胎牛血清為杭州江濱公司產品;ImPro-II逆轉錄試劑盒購自Promega公司;限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自NEB公司;谷胱甘肽瓊脂糖珠4B購自AmershamPharmaciaBiotechnology公司;辣根過氧化物酶標記的GST抗體、Cdc25C磷酸酶底物3-OMFP購自Sigma公司;引物合成和測序由北京奧科生物技術有限公司完成。

      2.MCF-7細胞培養及總RNA提取:用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM培養基,于37℃、5%CO2培養箱中培養MCF-7細胞。收集MCF-7細胞,計數,在約5×106細胞中加入350μLRLT裂解液,充分混勻后加入等體積的70%乙醇,混勻并轉移至RNA吸附柱中,8000r/min離心15s,棄上清液;加入700μLRW1液,8000r/min離心15s,棄上清液;加入500μLRPE液,8000r/min離心15s,棄上清液,重復1次;將吸附柱轉移到一個新的2mL的離心管中,較大轉速離心1min后加入30~50μL不含RNase的水,較大轉速離心1min后,將RNA洗脫至1.5mL的EP管中。

      3.RT-PCR擴增cdc25c基因:采用ImPro-II逆轉錄試劑盒,取1μgRNA為模板,以oligo(dT)15和隨機引物逆轉錄合成cDNA(反應條件:25℃5min,42℃1h)。70℃、15min滅活反應體系中的逆轉錄酶和RNase抑制劑。以該cDNA為模板,以正向特異性引物5'-GCGGGATCCATGTCTACGGAACTCTTCTCATC-3'(含BamHⅠ酶切位點)、反向引物5'-ATTCCGCTCGAGTCATGGGCTCATGTCCTTCACC-3('含XhoⅠ酶切位點)擴增cdc25c基因序列。將PCR擴增產物及載體pGEX-4T-1分別用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后連接,轉化大腸桿菌感受態DH5α,篩選陽性克隆進行酶切鑒定。

      4.GST-Cdc25C蛋白的誘導表達:將pGEX-GST-Cdc25C質粒轉化大腸桿菌感受態BL21,接種至氨芐西林抗性的LB培養基中,37℃、200r/min培養至D600nm為0.6~0.8,加入IPTG至終濃度為1mmol/L,12℃、200r/min培養6~8h,收獲菌體,超聲波低溫破碎菌體,離心后取上清,加入4×SDS上樣緩沖液[200mmol/LTris-HCl(pH6.8),8%SDS,4%溴酚藍,40%甘油、10%β-巰基乙醇],沸水浴5min,將樣品進行SDS-PAGE。

      5.GST-Cdc25C蛋白的純化:在菌體上清中加入谷胱甘肽(GSH)瓊脂糖珠4B,4℃旋轉孵育2h,1000r/min離心,棄上清,用PBS緩沖液洗3次,備用;分別向結合GST的GSH瓊脂糖珠、與GST-Cdc25C結合的GSH瓊脂糖珠中加入1×SDS上樣緩沖液[50mmol/LTris-HCl(pH6.8),2%SDS,1%溴酚藍,10%甘油、2.5%β-巰基乙醇],沸水浴5min,離心后取上清進行SDS-PAGE。

      6.免疫印跡分析:SDS-PAGE結束后,將膠用半干轉膜法轉移到PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉1h,加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的GST抗體,室溫孵育1h,用PBST洗膜3次,每次5min,較后將含有辣根過氧化物酶底物的ECL滴加到膜上,在暗室中進行X線膠片顯影。

      7.磷酸酶活性分析:在300μL磷酸酶反應緩沖液[50mmol/LTris-HCl(pH8.0),50mmol/LNaCl,1.0mmol/LEDTA,5mmol/LDTT,0.1%BSA]中分別加入1μg純化的GST蛋白和GST-Cdc25C蛋白,隨后加入Cdc25C的磷酸酶底物3-OMFP(終濃度150μmol/L),37℃溫育,用熒光分光分度計在490nm激發光波長、530nm發射光波長處檢測反應產物的熒光強度,熒光強度值的增加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。

      結果

      GST-Cdc25C融合表達質粒的構建:為了獲得cdc25c基因,我們首先提取了MCF-7細胞總RNA,用RT-PCR逆轉錄獲得MCF-7cDNA庫,并用cdc25c特異性引物從cDNA庫中擴增獲得cdc25c基因,PCR產物電泳鑒定結果見圖1。測序結果表明,該PCR產物序列與cdc25c基因序列(GenBankNo.BC019089)一致。隨后,通過BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點將cdc25c基因的PCR產物克隆至pGEX-4T-1載體上,GST-Cdc25C融合表達陽性克隆雙酶切鑒定結果如圖1所示。

      GST-Cdc25C融合蛋白的表達及純化:用大腸桿菌BL21感受態細胞表達GST-Cdc25C融合蛋白,誘導表達條件為低溫12℃、6~8h。收集菌體,于15mL冰浴的PBST(含蛋白酶抑制劑1片/25mL)中超聲波破碎4min,使可溶性GST-Cdc25C融合蛋白釋放到上清液中。SDS-PAGE結果表明,與GST對照組相比,在相對分子質量約87×103位置出現了顯著條帶(圖2A),與GST-Cdc25C蛋白的相對分子質量一致,說明GST-Cdc25C在大腸桿菌BL21中獲得了可溶性表達。隨后,用GSH瓊脂糖珠與裂解上清混勻,4℃旋轉孵育2h,離心得到純化的相對分子質量為87×103的GST-Cdc25C融合蛋白,并存在一定程度的降解。免疫印跡實驗進一步表明,GST-Cdc25C融合蛋白及GST對照蛋白均獲得表達及純化(圖2B)。

      GST-Cdc25C的磷酸酶活性分析:以3-OMFP為Cdc25C磷酸酶反應底物,在磷酸酶活性反應體系中分別加入1μgGST和GST-Cdc25C融合表達蛋白,37℃溫育,每隔5min用熒光分光分度計檢測反應產物的熒光強度,熒光強度增加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。用熒光強度值相對時間變化繪圖,結果如圖3,與GST蛋白相比,加入GST-Cdc25C融合蛋白的反應體系的熒光值顯著升高且速率穩定(基本呈線性),說明原核表達的GST-Cdc25C具有顯著的穩定的磷酸酶活性。

      討論

      在成功釣取人源cdc25c全長基因的基礎上,我們表達純化了具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白。由于GST-Cdc25C在表達過程中容易形成天然二硫鍵,易導致包涵體的形成,且結構的不穩定增加,因此存在一定程度的降解。Cdc25C在調控細胞周期G2/M轉換過程中有重要作用,其磷酸酶活性對于激活Cdc2/周期蛋白B復合體,開啟細胞有絲分裂進程至關重要。目前發現的Cdc25C上游調節分子主要通過相互作用及磷酸化或泛素化修飾調節Cdc25C的磷酸酶活性及亞細胞定位,進而影響細胞周期的進程。本研究中,我們表達純化出具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白,為研究c-Abl酪氨酸激酶通過Cdc25C調控G2/M轉換的分子機理提供了基礎。(本文圖略)

      本文作者:張鵬 劉萱 曹誠 單位:北京軍事醫學科學院 生物工程研究所 

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